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富集分析：（五）clusterProfiler：Visualization

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介绍了富集分析R包clusterProfiler富集结果的可视化，以及其他富集分析结果使用clusterProfiler进行可视化的操作。

(全文约4000字)

clusterProfiler相关的博客共有三篇，共同食用，效果更好 :wink: ：

1. 可视化的输入数据

clusterProfiler的可视化一般只支持clusterProfiler富集分析结果的可视化，通过认识clusterProfiler可视化接受的输入数据的格式，可以修改其他富集分析结果文件的格式，来用clusterProfiler进行可视化绘图。

1.1. 可视化输入数据格式

  1. 查看ego格式
    clusterProfiler的可视化包接受的输入数据是前面富集分析得到的结果(比如ego/kk)，用str(ego)或class(ego)可以看到ego的格式是叫enrichResult的R的数据类型。
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    library(clusterProfiler)
    > class(ego) #查看ego的数据类型/类
    [1] "enrichResult"
    attr(,"package")
    [1] "DOSE"

如果手头没有ego数据，可以用clusterProfiler的样例数据快速得到一个edo，与ego格式一样。

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library(clusterProfiler)
data(geneList) #导入示例数据
de <- names(geneList)[abs(geneList) > 2] #得到差异表达的基因
edo <- enrichDGN(de) #进行富集分析
class(ego) #查看edo的数据类型/类

  1. enrichResult(R的class类型)格式
    在DOSE包中查到，enrichResult具体格式如下：

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    setClass("enrichResult",
             representation=representation(
               result         = "data.frame",
               pvalueCutoff   = "numeric",           
               pAdjustMethod  = "character",           
               qvalueCutoff   = "numeric",           
               organism       = "character",           
               style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(221, 17, 68);">"character",          
               gene           = "character",           
               keytype        = "character",           
               universe       = "character",           
               gene2Symbol    = "character",           
               geneSets       = "list",           
               readable       = "logical" 
             ),         
             prototype=prototype(readable = FALSE)
    )

  2. result变量格式
    enrichResult中最重要的是result，是储存富集结果的dataframe。
    result变量与clusterProfiler富集分析中保存ego的结果文件是一致的。

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ego@result[c(13,14),] #查看ego的result变量的13，14行
   ONTOLOGY         ID                        Description GeneRatio   BgRatio   pvalue    p.adjust      qvalue      geneID   Count
13       BP GO:0010051 xylem and phloem pattern formation    3/349 129/16975    1.431350e-05 0.001294821 0.001099880   mc40782/mc40784/mc40918   3
14       BP GO:0048598            embryonic morphogenesis    2/349 131/16975    1.673394e-05 0.001405651 0.001194023   mc40784/mc40918   2

一般而言result有9列。这里因为用enrichGO富集时ont参数选择ALL，结果就会在第一列前多一列ONTOLOGY。

  • 第一列是ID,也就是富集通路的编号(GO:0010222)；
  • 第二列是Description，也就是富集通路的名称；
  • 第三列是GeneRatio，也就是要富集的基因中在对应通路中的比例；
  • 第4列是BgRation,也就是对应通过的基因在全基因组注释中的比例；
  • 第5,6,7列都是统计检验的结果；
  • 第8列是geneID，也就是富集到基因的名字，多个geneID是以斜线隔开的；
  • 第9列是Count，也就是富集到的基因数目。

1.2. 输入数据准备

根据不同情况为clusterProfiler的可视化准备输入数据。

  1. 接着clusterProfiler富集分析做可视化
    如果是接着clusterProfiler的enrichGO(),gseGO(),enricher(),gseGO()等函数的结果ego，不要关闭R环境，在R里直接进行用于下一步可视化即可。

  2. 保存的clusterProfiler富集分析结果做可视化

  • 如果是clusterProfiler的enrichGO(),gseGO(),enricher(),gseGO()等函数的结果ego保存成的文件，已关闭R环境。
  • 可导入文件，新建enrichResult对象ego，再进行下一步可视化。
  • 这里假设用R命令write.table(as.data.frame(ego),"go_enrich.csv",sep="\t",row.names =F,quote=F)保存ego在go_enrich.csv文件。
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    data<-read.table("go_enrich.csv",sep="\t",header=T,quote="")
    head(data,2) #查看data前2行
      ONTOLOGY         ID                                 Description GeneRatio
    1       BP GO:0010222      stem vascular tissue pattern formation    12/349
    2       BP GO:0010588 cotyledon vascular tissue pattern formation    12/349
       BgRatio       pvalue     p.adjust       qvalue
    1 29/16975 1.792157e-13 2.107577e-10 1.790270e-10
    2 39/16975 1.122611e-11 6.600951e-09 5.607145e-09
               geneID
    1 mc11300/mc11301/mc19080/mc19081/mc26300/mc31693/mc37850/mc40780/mc40781/mc40782/mc40784/mc40918
    2 mc11300/mc11301/mc19080/mc19081/mc26300/mc31693/mc37850/mc40780/mc40781/mc40782/mc40784/mc40918
      Count
    1    12
    2    12

    geneID_all <- unlist(apply(as.matrix(data$geneID),1,function(x) unlist(strsplit(x,'/')))) #得到富集到的所用geneID

    ego<-new("enrichResult", result=data, gene=geneID_all, pvalueCutoff=0.01,pAdjustMethod="BH",qvalueCutoff=0.05,ontology="BP",keytype="GID",universe='Unknown',geneSets=list(),organism="Unknown",readable=FALSE) #把data内容赋值给ego的result，geneID_all赋值给gene，每个富集到的GO对应的gene集应该赋值给geneSets(数据是字典(键值对是GOID和geneIDs)组成的列表，这里直接给了空的)，ontology与enrichGO分析的ont参数一致，这里的pvalueCutoff=0.01,pAdjustMethod="BH",qvalueCutoff=0.05根据富集分析参数的设置，或者随意设置或者不设置也不会影响可视化。
  1. 其他来源富集分析结果可视化
    如果是其他软件的富集分析结果，可以根据ego的result变量格式进行修改格式，改成go_enrich.csv相同的格式的文件，再按照上面的步骤导入文件，并保存到新建的ego对象。即可用clusterProfiler的可视化包可视化其他软件的富集分析结果了。

2. 功能富集结果可视化

下面的可视化大多基于在R中已获得富集分析的结果ego。

2.1. enrichplot包

enrichplot包有几种可视化方法来解释富集结果，支持clusterProfiler获得的ORA和GSEA富集结果。

2.1.1. 安装和载入

安装和载入enrichplot包

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BiocManager::install("enrichplot")
library(enrichplot)

2.1.2. 可视化包

  • 推荐dotplot或barplot可视化前10个GO Terms条目。
  • 推荐goplot有向无环图查看富集的GO Terms间的关系。
  1. 可视化barplot —— 条形图
    将富集分数（例如p 值）和基因计数或比率描述为条形高度和颜色。横轴为该GO term下的差异基因个数，纵轴为富集到的GO Terms的描述信息， showCategory指定展示的GO Terms的个数为20个，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。

barplot(ego, showCategory=20, title="EnrichmentGO_MF")

使用mutate导出的其他变量也可以用作条形高度或颜色。

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mutate(ego, qscore = -log(p.adjust, base=10)) %>% 
    barplot(x="qscore")

Figure 1. Bar plot of enriched terms
from clusterProfiler book

  1. 可视化dotplot —— 点阵图
    dotplot(edo, showCategory=30) + ggtitle("dotplot for ORA")

dotplot(edo2, showCategory=30) + ggtitle("dotplot for GSEA")

散点图，横坐标为GeneRatio，纵坐标为富集到的GO Terms的描述信息，showCategory指定展示的GO Terms的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。

Figure 2. Dot plot of enriched terms
from clusterProfiler book

  1. 可视化cnetplot —— 类别网络图
    cnetplot 将基因和生物学概念（例如 GO 术语或 KEGG 通路）的联系描述为一个网络（有助于查看哪些基因涉及富集通路和可能属于多个注释类别的基因）。对于基因和富集的GO terms之间的对应关系进行展示，如果一个基因位于一个GO Terms下，则将该基因与GO连线。图中灰色的点代表基因，黄色的点代表富集到的GO terms, 默认画top5富集到的GO terms, GO 节点的大小对应富集到的基因个数。

cnetplot(ego, categorySize = "pvalue", foldChange = gene_list

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## convert gene ID to Symbol
edox <- setReadable(ego, 'org.Hs.eg.db', 'ENTREZID')
p1 <- cnetplot(edox, foldChange=geneList)
## categorySize can be scaled by 'pvalue' or 'geneNum'
p2 <- cnetplot(edox, categorySize="pvalue", foldChange=geneList)
p3 <- cnetplot(edox, foldChange=geneList, circular = TRUE, colorEdge = TRUE) 
cowplot::plot_grid(p1, p2, p3, ncol=3, labels=LETTERS[1:3], rel_widths=c(.8, .8, 1.2))

Figure 3. Network plot of enriched terms
from clusterProfiler book

  1. 可视化heatplot —— 类热图功能分类
    同样使用edox。
    heatplot类似cnetplot，而显示为热图的关系。
    如果用户想要显示大量重要术语，那么类别网络图可能会过于复杂。在heatplot能够简化结果和更容易识别的表达模式。
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p1 <- heatplot(edox, showCategory=5)
p2 <- heatplot(edox, foldChange=geneList, showCategory=5)
cowplot::plot_grid(p1, p2, ncol=1, labels=LETTERS[1:2])

Figure 4. Heatmap plot of enriched terms
from clusterProfiler book

  1. 可视化treeplot —— 树状图
    treeplot()函数执行丰富术语的层次聚类。它依赖于pairwise_termsim()函数计算的丰富项的成对相似性，默认情况下使用 Jaccard 的相似性指数 (JC)。如果支持，用户还可以使用语义相似度值（例如，GO、DO和MeSH）。

默认聚合方法treeplot()是ward.D，用户可以通过hclust_method参数指定其他方法（例如，’average’、’complete’、’median’、’centroid’等。

treeplot()函数会将树切割成几个子树（由nCluster参数指定（默认为 5））并使用高频词标记子树。

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edox2 <- pairwise_termsim(edox)
p1 <- treeplot(edox2)
p2 <- treeplot(edox2, hclust_method = "average")
aplot::plot_list(p1, p2, tag_levels='A')

Figure 5. Tree plot of enriched terms
from clusterProfiler book

  1. 可视化emapplot —— 富集图
    对于富集到的GO terms之间的基因重叠关系进行展示，如果两个GO terms系的差异基因存在重叠，说明这两个节点存在overlap关系，在图中用线条连接起来。每个节点是一个富集到的GO term, 默认画top30个富集到的GO terms, 节点大小对应该GO terms下富集到的差异基因个数，节点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色。
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ego2 <- pairwise_termsim(ego)
p1 <- emapplot(ego2)
p2 <- emapplot(ego2, cex_category=1.5)
p3 <- emapplot(ego2, layout="kk")
p4 <- emapplot(ego2, cex_category=1.5,layout="kk") 
cowplot::plot_grid(p1, p2, p3, p4, ncol=2, labels=LETTERS[1:4])

Figure 6. Plot for results obtained from hypergeometric test and gene set enrichment analysis. default (A), cex_category=1.5 (B), layout=”kk” (C) and cex_category=1.5,layout=”kk” (D).
from clusterProfiler book

  1. 可视化upsetplot —— upset图
    upsetplot是cnetplot可视化基因和基因集之间复杂关联的替代方法。它强调不同基因集之间的基因重叠。

upsetplot(ego)

Figure 7. Upsetplot for over-representation analysis.
from clusterProfiler book

  1. 可视化ridgeplot —— 脊线图
    ridgeplot将可视化核心富集基因的表达分布为GSEA富集类别。它帮助用户解释上调/下调的途径。

ridgeplot(ego)

Figure 8. Ridgeplot for gene set enrichment analysis.
from clusterProfiler book

2.2. 可视化plotGOgraph/goplot —— 有向无环图

  1. plotGOgraph(ego, firstSigNodes=10)
  • 有向无环图(Directed acyclic graph, DAG)，矩形代表富集到的top10个GO Terms，颜色从黄到红，对应p值从大到小。和topGO做富集分析的DAG图一样。

当enrichGO富集分析时ont参数选了ALL时，结果文件会在第一列前增加一列ONTOLOGY为子类，这时直接用于plotGOgraph画图会报错。
试了下，下面两种方案还是会报错Error in if (!ont %in% c(“BP”, “MF”, “CC”)) { :argument is of length zero。。还是尽量在enrichGO分析时就用ont=”BP”吧。

  • 可以在结果文件中筛选出特定子类(比如BP)的结果行，并删除第一列ONTOLOGY后保存文件，再读进R用于plotGOgraph画图。
  • 也可以在R内用命令ego2<-ego%>%filter(ONTOLOGY== "BP")筛选BP子类，接着用ego3<-ego2%>%select(!ONTOLOGY)或者ego3<-ego2[,-1]删除第一列(即ONTOLOGY列)，然后用plotGOgraph(ego3)作图。

Figure 9. DAG图
from clusterProfiler blog

  1. goplot(ego, showCategory = 10)
  • igraph布局方式的有向无环图

Figure 10. goplot的DAG图
from clusterProfiler book

2.3. 可视化 —— wordcloud

词云的方式显示结果

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install.packages("wordcloud")
library(wordcloud)
wcdf <- read.table(text = ego$GeneRatio, sep = "/")[1]
wcdf$term <-  ego[,2]
wordcloud(words = wcdf$term, freq = wcdf$V1, scale=(c(4, .1)), colors=brewer.pal(8, "Dark2"), max.words = 25)

Figure 11. wordcloud词云图
from NGS Analysis ebook

3. 导出可视化结果

  1. Rstudio

如果是在Rstudio中，可以直接看到绘图结果，导出需要的文件格式即可。

  1. 代码导出
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    pdf("ego.pdf") #如果保存png，就改成png("ego.png")
    ego_fig<-barplot(x) #画图函数
    print(ego_fig) #画到pdf文件
    dev.off() #关闭pdf画板

4. references

  1. clusterProfiler github：https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler
  2. clusterProfiler paper：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(21)00066-7?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2666675821000667%3Fshowall%3Dtrue
  3. clusterProfiler book：http://yulab-smu.top/biomedical-knowledge-mining-book/index.html
  4. clusterProfiler manual：https://bioconductor.org/packages/devel/bioc/manuals/clusterProfiler/man/clusterProfiler.pdf
  5. clusterProfiler ducumentation：https://guangchuangyu.github.io/software/clusterProfiler/documentation/
  6. 其他来源结果可视化：https://cloud.tencent.com/developer/article/1613815
  7. wordcloud：https://learn.gencore.bio.nyu.edu/rna-seq-analysis/over-representation-analysis/
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