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RNA-sequencing数据分析工具比较

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RNA-sequencing数据分析工具的比较，学习文章内容的笔记。

1. background

2017年nature communications上发表的Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis，对RNA-sequencing(RNA-seq)数据的39种分析工具做了比较和总结。

RNA-seq分析流程主要有四大模块：

  • RNA-seq变异分析(Genomic variants)
  • 短读长数据的亚型检测(Short-read isoform detection)
  • 长读长数据的亚型jiance(Long-read isoform detection)
  • 表达分析(Expression analysis)

Figure 1. RNACocktail分析协议
from paper: Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

2. 比较结果总结

  1. 比对工具：HISAT2在准确性和运算速度上表现最好值得推荐，STAR和TopHat在剪切位点总数上表现更好。
  2. 有参组装工具：StringTie在组装的转录本数量，转录本水平的准确性和运行速度上都表现最好，Cufflinks表现一般，isoform detection and prediction(IDP)在基因水平准确性上表现最好。
  3. 从头组装工具：Trinity转录本长，灵敏度高；SOAPdenovo-Trans转录本多，准确性高；Oases鉴定长转录本有优势，能够较好地涵盖到低表达的基因。
  4. 三代测序错误纠正工具：LoRDEC在纠错质量和速度上更有优势，LSC在纠正后reads比对率的改善上表现更好。
  5. 全长转录本亚型检测工具：注重质量选GMAP，注重速度选STARlong。
  6. 转录本的定量：Salmon-SMEM(不经过比对)运行速度和表现都更好；StringTie(基于基因组)的定量结果更接近于不基于基因组比对的工具结果。
  7. 差异表达的工具：DESeq2在各项得分中均优于其他的工具。
  8. 检测基因组和转录组的突变：GATK在突变检测方面具有较高的准确性，在运行时间方面GATK与Samtools没有明显的差异。

作者总结了每一步的高精度工具，作为RNA-seq分析工具选择的一般建议。

Figure 2. RNACocktail计算流程
from paper: Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

3. 比较结果

3.1. 比对工具

3.1.1. 比对工具用法

RNA-seq分析的第一步通常是转录本的鉴定，需要把RNA-seq reads比对到合适的参考序列上。

如果用基因组作为参考序列可以检测到新的转录本，但可能需要耗费更多的计算资源；如果用转录组作为参考则无法找出新的转录本，但速度更快。如果研究物种没有可靠的参考序列，可以重头组装对转录本进行鉴定。

比对工具可以把RNA-seq short reads往参考基因组上进行mapping，做比对(alignment)，进行剪切点预测(junction prediction)和exon-intron边界的预测。

3.1.2. 比对结果

比较了三款比对主流软件，HISAT2在准确性和运算速度上表现最好值得推荐，STAR和TopHat在剪切位点总数上表现更好。

  • HISAT2在所有样品中能检测到的剪接位点验证率最高，但找到的剪接位点总数则比TopHat和STAR都要少。在运行速度方面，HISAT2则有较大的优势，比STAR快大约2.5倍并且比TopHat快大约100倍。
  • STAR对于成对reads的唯一比对表现则比较好，特别是对于有较长读长的MCF7-300细胞系的数据，不过STAR会有更多含有soft-clipped和碱基错配的较低质量比对情况。
  • 如果单看有soft-clipped的reads，TopHat会把这部分reads全部舍弃。

Figure 3. 比对工具比较结果
from paper: Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

3.2. 有参组装工具

比对完成后，接着组装转录本。比较了三款组装工具，StringTie在组装的转录本数量，转录本水平的准确性和运行速度上都表现最好，Cufflinks表现一般，isoform detection and prediction(IDP)在基因水平准确性上表现最好。

  • 转录本数量：StringTie>Cufflinks~IDP
  • 基因水平准确性和灵敏度：IDP>Cufflinks>StringTie
  • 转录本水平准确性：StringTie>IDP>Cufflink
  • 运行速度：StringTie>Cufflinks~IDP
  • IDP则会忽略单外显子转录本

Figure 4. 有参组装工具比较结果
from paper: Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

3.3. 从头组装工具

比较了三款从头组装转录本的工具：Trinity转录本长，灵敏度高；SOAPdenovo-Trans转录本多，准确性高；Oases鉴定长转录本有优势，能够较好地涵盖到低表达的基因。

  • Trinity：组装的转录本较长，灵敏度高。
  • SOAPdenovo-Trans：组装到转录本数量多，准确性最高，对于高表达的转录本有明显的组装偏好性；花费的内存和CPU最低。
  • Oases：在所有样品中都有较好的N10-N50长度的表现，鉴定长转录本有优势；能够较好地涵盖到低表达的基因。

Figure 5. 从头组装工具比较结果
from paper: Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

3.4. 三代测序错误纠正工具

LoRDEC在纠错质量和速度上更有优势，LSC在纠正后reads比对率的改善上表现更好。

  • LoRDEC：纠正后的reads质量更高，运行速度比LSC快100倍。
  • LSC：纠正后的reads比对率提高更多。

3.5. 全长转录本亚型检测工具

注重质量选GMAP，注重速度选STARlong。

  • GMAP：比对到参考序列的reads数量更多。
  • STARlong：运行速度快68倍。

3.6. 转录本的定量

3.6.1. 转录本定量软件

  1. 基于比对的转录本定量
  • 传统方法是将read比对(spliced -aligned)到参考基因组，然后利用Cufflinks和StringTie进行转录本组装，最后进行定量。
  • 如果具有参考转录本序列，reads可以直接跟转录本序列比对(aligned)，然后使用Salmon-Aln和eXpress进行定量。
  1. 不经过比对(alignment-free)的转录本定量
  • 主要提供了四个工具：Sailfish、Salmon-SMEM、quasi-mapping和kallisto。
  1. 基于长读长技术的IDP（使用不同的短读长和长读长比对工具）

3.6.2. 比较结果

  • StringTie的定量结果更接近于不基于基因组比对的工具结果。
  • 基于转录组比对的两款工具则和Salmon-SMEM的相关性更高，考虑到Salmon-SMEM更快的运行速度，eXpress和Salmon-Aln可能使用体验不如Salmon-SMEM。
  • kallisto和Salmon-SMEM表现最好。
  • 基于比对基因组的工具则能够看到，使用HISAT2或者TopHat对具有较长读长的样品进行比对所得到的定量结果要比STAR要好。

Figure 6. 转录本表达定量比较结果
from paper: Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

3.7. 差异表达的工具

比较了基于计数的工具（DESeq2、limma和edgeR）和基于组装的工具（Cuffdiff和Ballgown）。

DESeq2在各项得分中均优于其他的工具，而Cuffdiff和Ballgown的表现则相对比较差。
总的来说，基于计数的工具要比基于组装的工具效果要好；另外从运行时间上看的话，Cuffdiff也是最慢的工具。

Figure 7. 差异表达比较结果
from paper: Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

3.8. 检测基因组和转录组的突变

两款突变检测的工具：GATK HaplotypeCaller和Samtools mpileup。

GATK在突变检测方面具有较高的准确性，在运行时间方面GATK与Samtools没有明显的差异。

Figure 8. 突变检测比较结果
from paper: Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis

4. 39个RNA-seq分析工具版本号、重要参数及下载地址

4.1. 比对工具 —— Reference-based transcript identification

  1. TopHat2： –no-coverage-search
    http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
  2. STAR: -twopassMode Basic –outFilterType BySJout
    https://github.com/alexdobin/STAR/releases
  3. HISAT2 2.0.1-beta –dta (or –dta-cufflinks)
    http://www.ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml
  4. RASER 0.52 -b 0.03
    https://www.ibp.ucla.edu/research/xiao/RASER.html

4.2. 有参考转录本组装工具

  1. Cufflinks 2.2.1 –frag-bias-correct
    http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/
  2. StringTie 1.2.1 -v -B
    http://www.ccb.jhu.edu/software/stringtie/

4.3. 无参考转录本组装工具

  1. SOAPdenovoTrans 1.04 -K 25
    https://github.com/aquaskyline/SOAPdenovo-Trans/
  2. Oases 0.2.09 (Velvetv1.2.10) (velveth haslength: 25) (velvetg options: -read trkg yes)
    http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/oases/
  3. Trinity 2.1.1 –normalize reads
    http://trinityrnaseq.sourceforge.net/

4.4. 三代长read分析工具

  1. LoRDEC 0.6 -k 23 -s 3
    http://atgc.lirmm.fr/lordec/
  2. GMAP 12/31/15 -f 1
    http://research-pub.gene.com/gmap/
  3. STARlong 2.5.1b
    https://github.com/alexdobin/STAR/releases

Followed the recommended options :

  • –outSAMattributes NH HI NM MD
  • –readNameSeparator space
  • –outFilterMultimapScoreRange 1
  • –outFilterMismatchNmax 2000
  • –scoreGapNoncan -20
  • –scoreGapGCAG -4
  • –scoreGapATAC -8
  • –scoreDelOpen -1
  • –scoreDelBase -1
  • –scoreInsOpen -1
  • –scoreInsBase -1
  • –alignEndsType Local
  • –seedSearchStartLmax 50
  • –seedPerReadNmax 100000
  • –seedPerWindowNmax 1000
  • –alignTranscriptsPerReadNmax 100000
  • –alignTranscriptsPerWindowNmax 10000
  • –outSAMstrandField intronMotif
  • –outSAMunmapped Within
  1. IDP 0.1.9
    https://www.healthcare.uiowa.edu/labs/au/IDP/

4.5. 定量工具

  1. eXpress 1.5.1 (bowtie2 v2.2.7) (bowtie2 options: -a -X 600 –rdg 6,5 –rfg 6,5 –score-min L,-.6,-.4 –no-discordant –no-mixed)
    https://pachterlab.github.io/eXpress/index.html
  2. kallisto 0.42.4
    http://pachterlab.github.io/kallisto/about.html
  3. Sailfish 0.9.0
    http://www.cs.cmu.edu/~ckingsf/software/sailfish/
  4. Salmon-Aln 0.6.1
    https://github.com/COMBINE-lab/salmon
  5. Salmon-SMEM 0.6.1
    https://github.com/COMBINE-lab/salmon
    index: –type fmd
    quant: -k,19
  6. Salmon-Quasi 0.6.1
    https://github.com/COMBINE-lab/salmon
    index: –type quasi -k 31
  7. featureCounts 1.5.0-p1 -p -B -C
    http://subread.sourceforge.net/

4.6. 差异表达分析工具

  1. DESeq2 1.14.1
    http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html
  2. edgeR 3.16.5
    http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
  3. limma 3.30.7
    http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
  4. Cuffdiff 2.2.1
    –frag-bias-correct –emit-count-tables
    http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/
  5. Ballgown 2.6.0
    https://github.com/alyssafrazee/ballgown
  6. sleuth 0.28.1
    https://github.com/pachterlab/sleuth

4.7. 变异分析工具

  1. SAMtools 1.2 (bcftools v1.2)
    samtools mpileup -C50 -d 100000
    https://github.com/samtools/samtools
  2. bcftools filter -s LowQual -e ‘%QUAL<20 —— DP>10000’
    https://github.com/samtools/bcftools
  3. GATK v3.5-0-g36282e4 (picard 1.129)
    https://software.broadinstitute.org/gatk/download/
    Picard AddOrReplaceReadGroups: SO=coordinate
    Picard MarkDuplicates: CREATE INDEX=true VALIDATION STRINGENCY=SILENTGATK
    SplitNCigarReads: -rf ReassignOneMappingQuality -RMQF 255 -RMQT 60

-U ALLOW N CIGAR READSGATK
HaplotypeCaller: -stand call conf 20.0
-stand emit conf 20.0 -A StrandBiasBySample
-A StrandAlleleCountsBySampleGATK
VariantFiltration: -window 35 -cluster 3 -filterName FS -filter
“FS >30.0” -filterName QD -filter “QD <2.0”

4.8. RNA编辑

  1. GIREMI 0.2.1
    https://github.com/zhqingit/giremi
  2. Varsim 0.5.1
    https://github.com/bioinform/varsim

4.9. 基因融合

  1. FusionCatcher 0.99.5a beta
    https://github.com/ndaniel/fusioncatcher
  2. JAFFA 1.0.6
    https://github.com/Oshlack/JAFFA
  3. SOAPfuse 1.27
    http://soap.genomics.org.cn/soapfuse.html
  4. STAR-Fusion 0.7.0
    https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion
  5. TopHat-Fusion 2.0.14
    http://ccb.jhu.edu/software/tophat/fusion_index.shtml
    s

5. references

  1. paper：https://www.nature.com/articles/s41467-017-00050-4
  2. https://mp.weixin.qq.com/s/hp_wxiLDI9EVB8Z3L1bxbw
  3. https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9959008.html
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