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基因组质量评估：（三）用BUSCO评估基因组的完整性

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记录评估基因组组装和注释完整性的工具BUSCO的安装使用。

1. busco简介

Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO)是用于评估基因组组装和注释的完整性的工具。通过与已有单拷贝直系同源数据库的比较，得到有多少比例的数据库能够有比对，比例越高代表基因组完整度越好。

可以评估三种数据类型：

  1. 组装的基因组；
  2. 转录组；
  3. 蛋白组（或者基因组注释基因对应的氨基酸序列）。

使用需要评估的生物类别所属的数据库（从busco数据库下载）比对，得出比对上数据库的完整性比例的信息。

2. busco安装

  1. conda安装

conda install -c conda-forge -c bioconda busco=5.3.2 #安装版本是5.3.2

  1. 手动安装
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git clone https://gitlab.com/ezlab/busco.git
cd busco
python3 setup.py install --user
./bin/busco -h

3. busco数据库下载

busco --list-datasets #查看busco可用的数据库。

下载对应的busco数据库；目前有v1-v5版本，根据需要评估的物种，尽量选用最新版本的最多基因的数据库。

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wget https://busco-data.ezlab.org/v5/data/lineages/eudicots_odb10.2020-09-10.tar.gz
tar -xzf eudicots_odb10.2020-09-10.tar.gz #会生成eudicots_odb10，这个就可以直接用了，注意不要修改后缀，必需是_odb10

植物相关的数据库有：

类群 数据库 BUSCO groups数量
真核生物 eukaryota_odb10.2020-09-10.tar.gz 255
绿色植物 viridiplantae_odb10.2020-09-10.tar.gz 425
有胚植物 embryophyta_odb10.2020-09-10.tar.gz 1614
真双子叶植物 eudicots_odb10.2020-09-10.tar.gz 2326
豆目 fabales_odb10.2020-08-05.tar.gz 5366

4. busco使用

4.1. 直接在命令中设定参数【需设置的参数较少时】

nohup busco -i genome.fa -c 10 -o busco -m geno -l busco_downloads/eudicots_odb10 --offline &

  • -i：指定需要分析的数据，组装的genome或者注释的蛋白序列或者组装的转录组dna序列;
  • -m：geno/prot/tran模式；
  • -c：指定线程；
  • -o：指定输出文件目录名；
  • -l：指定数据库
  • 使用–offline离线模式

非常不建议用busco的–auto-lineage模式，这个模式在运行busco时下载数据库，网络不好时连接的失败率非常高。推荐用-l busco_downloads/eudicots_odb10 --offline指定下载好的本地数据库，并使用离线模式。

4.2. 在设置文件中给出参数【需设置的参数较多时】

nohup busco --config config.ini
通过conda安装的config.ini配置文件在/path/to/miniconda3/envs/busco5/config/目录下；直接复制一份到工作目录，修改使用即可。

把config.ini的示例文件中行首的分号;去掉，并把等号后的内容修改成设置的内容。

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# This is the BUSCOv5 configuration file template.
# It is not necessary to use this, as BUSCO will use the dependencies available on your PATH by default.
# The busco run parameters can all be set on the command line. See the help prompt (busco -h) for details.
#
# To use this file for an alternative configuration, or to specify particular versions of dependencies:
# 1) edit the path and command values to match your desired dependency versions.
#    WARNING: passing a parameter through the command line overrides the value specified in this file.
#
# 2) Enable a parameter by removing ";"
#
# 3) Make this config file available to BUSCO either by setting an environment variable
#
#                   export BUSCO_CONFIG_FILE="/path/to/myconfig.ini"
#
#    or by passing it as a command line argument
#
#                   busco <args> --config /path/to/config.ini
#
[busco_run]
# Input file
;in = /path/to/input_file.fna
# Run name, used in output files and folder
;out = BUSCO_run
# Where to store the output directory
;out_path = /path/to/output_folder
# Path to the BUSCO dataset
;lineage_dataset = bacteria
# Which mode to run (genome / proteins / transcriptome)
;mode = genome
# Run lineage auto selector
;auto-lineage = True
# Run auto selector only for non-eukaryote datasets
;auto-lineage-prok = True
# Run auto selector only for eukaryote datasets
;auto-lineage-euk = True
# How many threads to use for multithreaded steps
;cpu = 16
# Force rewrite if files already exist (True/False)
;force = False
# Restart a previous BUSCO run (True/False)
;restart = False
# Blast e-value
;evalue = 1e-3
# How many candidate regions (contigs, scaffolds) to consider for each BUSCO
;limit = 3
# Metaeuk parameters for initial run
;metaeuk_parameters='--param1=value1,--param2=value2'
# Metaeuk parameters for rerun
;metaeuk_rerun_parameters=""
# Augustus parameters
;augustus_parameters='--param1=value1,--param2=value2'
# Quiet mode (True/False)
;quiet = False
# Local destination path for downloaded lineage datasets
;download_path = ./busco_downloads/
# Run offline
;offline=True
# Ortho DB Datasets version
;datasets_version = odb10
# URL to BUSCO datasets
;download_base_url = https://busco-data.ezlab.org/v4/data/
# Download most recent BUSCO data and files
;update-data = True
# Use Augustus gene predictor instead of metaeuk
;use_augustus = True

[tblastn]
path = /ncbi-blast-2.10.1+/bin/
command = tblastn

[makeblastdb]
path = /ncbi-blast-2.10.1+/bin/
command = makeblastdb

[metaeuk]
path = /metaeuk/build/bin/
command = metaeuk

[augustus]
path = /augustus/bin/
command = augustus

[etraining]
path = /augustus/bin/
command = etraining

[gff2gbSmallDNA.pl]
path = /augustus/scripts/
command = gff2gbSmallDNA.pl

[new_species.pl]
path = /augustus/scripts/
command = new_species.pl

[optimize_augustus.pl]
path = /augustus/scripts/
command = optimize_augustus.pl

[hmmsearch]
path = /usr/local/bin/
command = hmmsearch

[sepp]
path = /home/biodocker/sepp/
command = run_sepp.py

[prodigal]
path = /usr/local/bin/
command = prodigal

5. busco结果

结果在short_summary.txt后缀文件中。

一个例子

    --------------------------------------------------
    |Results from dataset eudicots_odb10              |
    --------------------------------------------------
    |C:92.9%[S:72.4%,D:20.5%],F:1.8%,M:5.3%,n:2326    |
    |2162   Complete BUSCOs (C)                       |
    |1685   Complete and single-copy BUSCOs (S)       |
    |477    Complete and duplicated BUSCOs (D)        |
    |41     Fragmented BUSCOs (F)                     |
    |123    Missing BUSCOs (M)                        |
    |2326   Total BUSCO groups searched               |
    --------------------------------------------------

结果的解释：
使用的eudicots_odb10真双子叶植物数据库中共有2326个BUSCO groups，其中2162（92.9%）个BUSCO groups被完整比对上（包括1685个单拷贝和477个多拷贝），41个部分比对上，123个没有比对上。

通常用完整比对上的占总共的BUSCO groups的比例作为BUSCO的重要结果，越高越好，这里是92.9%=2162/2326。

6. busco结果画图

在执行完毕之后，可以使用generate_plot.py画条形图，可以进行多个物种间同一个库结果的比较。

  1. 首先把所有的经过BUSCO检测的物种结果short_summary.txt后缀文件放到一个文件夹（result）下；
  2. 然后运行python busco/scripts/generate_plot.py –wd result；
  3. generate_plot.py会在指定的目录下识别short_summary.specific/genetic前缀文件，载入所有符合这个模式的文件，然后在result下生成busco_figure.R脚本。
  4. 然后运行这个脚本调用ggplot2生成图。如果当前环境的R中没有安装ggplot2，可以安装后自行运行脚本生成图。
  5. 可以修改busco_figure.R脚本以适应需要，比如修改标题（my_title），基因数量标签的尺寸（labsize）。

7. 调用augustus【optional】

AUGUSTUS运行的时候需要额外设定2个环境变量，AUGUSTUS_CONFIG_PATH和BUSCO_CONFIG_FILE, 通过conda安装的这两个配置文件都在/path/to/miniconda3/envs/busco5/config目录下。

所以需要在.bashrc或.zshrc中加入下面这一行：

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export AUGUSTUS_CONFIG_PATH="/path/to/anaconda3/envs/busco5/config
export BUSCO_CONFIG_FILE="/path/to/anaconda3/envs/busco5/config/config.ini

实现AUGUSTUS和BUSCO的设置。

8. notes

2021年06月23日开始写，07月24日今天终于完结。

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