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基因组测序简介

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介绍基因组测序技术的分类（包括第一代、第二代和第三代测序技术）、原理、优缺点和应用。

1. 基因组测序

  1. 基因组测序简介
  • DNA 测序是确定核酸序列（DNA 中核苷酸的顺序）的过程。它包括用于确定腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶（A G C T）四种碱基顺序的任何方法或技术。
  • 确定一个个体或一个细胞内的所有DNA序列的过程及基因组测序，通常是指细胞核基因组。
  1. 基因组测序技术
  • 目前测序技术包括一代测序（Sanger测序）、二代测序（Illumina高通量测序）、三代测序（PacBio SMRT和nanopore测序）。

Figure 1. 测序技术的历史

2. 一代测序

1977年第一代DNA测序技术（Sanger测序）被Sanger团队首次开发，1986年被首次商业化。

2.1. Sanger测序原理

  1. 最常用的是链终止法（Chain-termination methods）进行Sanger测序。
  2. Sanger测序（链终止法）的原理是使用荧光或放射性标记的二脱氧核苷酸三磷酸酯(ddNTPs)和普通脱氧核苷酸三磷酸酯(dNTPs)共同作为原材料根据单链DNA模板在DNA引物和DNA聚合酶作用下在体外进行DNA链的延伸。由于ddNTPs缺乏在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键所需的3-OH基团，所以ddNTPs会在结合后终止DNA链的延伸。

Figure 2. Sanger测序流程

  1. DNA 样品被分成四个独立的测序反应，每个反应体现都包含所有四种标准脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP）和 DNA 聚合酶。每个反应只加入四种二脱氧核苷酸（ddATP、ddGTP、ddCTP 或 ddTTP）中的一种。脱氧核苷酸的浓度应比相应的双脱氧核苷酸的浓度高约 100 倍（例如 0.5mM dTTP : 0.005mM ddTTP），这样才能在转录完整序列的同时产生足够的片段（但 ddNTP 的浓度也取决于所需的序列长度）。
  2. 在模板 DNA 与结合引物进行多轮延伸后，将产生的 DNA 片段加热变性，并使用凝胶电泳按大小进行分离。
  3. 通常采用变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶进行检测，四个反应分别在四条泳道（A、T、G、C泳道）中的一条进行。然后用自动射线照相法或紫外线照相法观察 DNA 条带，并可直接从 X 射线胶片或凝胶图像上读取 DNA 序列。

Figure 3. Sanger测序凝胶成像

2.2. Sanger测序特点和应用

  1. 优点：Sanger测序准确率约99.99%，是准确检测单核苷酸变异（SNP）和小插入/缺失（INDEL）的黄金标准方法。
  2. 缺点：一次只能对一条相对较短（300-1000 bp）的 DNA 片段进行测序。超过1000 bp的DNA片段难以分离，无法分辨凝胶成像中碱基顺序。
  3. 缺点：由于引物结合，序列前 15-40 个碱基的质量较差，以及 700-900 个碱基后测序痕迹的质量下降。
  4. 应用：Sanger测序被广泛用于检测已知的家族变异、验证通过 NGS 获得的结果以及某些单基因测序。

3. 二代测序

第二代测序技术也叫下一代测序技术（next generation sequencing, NGS）在1993-1998年间出现，2005年开始投入商业使用。

最常用的NGS测序是在Illumina HiSeq平台上进行边合成边测序（Sequencing by synthesis，SBS），通常是双端测序（Paired end），准确率约99.9%。

3.1. 二代测序（边合成边测序，Sequencing by synthesis，SBS）的步骤

  1. 体外PCR扩增，增强信号，制备DNA测序文库。
  2. 将待测序的DNA附着在固体载体上，在固体载体上生成单链DNA。
  3. 使用DNA聚合酶、dNTPs等以固体载体上的单链DNA为模板进行DNA合成。
  4. 对空间隔离的DNA模板同时进行大规模并行的边合成边测序。

3.2. 二代测序特点和应用

  1. 优点：高通量：Illumina一次运行可测序1M-43G条reads（每条reads 50-400个碱基），可以对整个基因组进行测序。
  2. 优点：价格低：相对第一代测序技术，在高通量的情况下价格比第一代低很多。
  3. 准确率（99.9%）低于第一代测序技术（99.99%），有时需要第一代测序技术的验证。
  4. 缺点：读长（reads）短：插入序列长度常为150bp，很少超过1000bp。
  5. 测序速度：Illumina一次运行需要1-11天。

4. 三代测序

第三代测序技术又叫长读长测序（Long-read sequencing），常用的测序技术包括Pacific Biosciences（PacBio）公司的单分子实时测序技术（Single-Molecule Real Time Sequencing technology, SMRT）和 Oxford Nanopore Technology公司的Nanopore的纳米孔测序技术。2008年以来一直在发展中。

4.1. 三代测序的特点

  1. 优点：读长（reads）长：SMRT测序reads的N50约为30kbp，最长reads可超过100kbp。
  2. 缺点：准确率低：SMRT测序CLR模式获得的reads的准确率约为87%，但2019年推出的CCS模式经过一致性校正后准确率可达99.9%。
  3. 中等通量：SMRT测序每次运行生成4M条reads。
  4. 便携性和速度：SMRT平台一次运行需要0.5-20小时。Oxford Nanopore Technology开发的MinlON测序仪，它只有U盘大小，可以便携和快速的检测。
  5. 可以直接检测表观遗传标志物：
  6. 不同于二代测序的碱基质量标准Q20/Q30，三代测序由于其随机分布的碱基错误率，其单碱基的准确性不能直接用于衡量数据质量。

4.2. 三代测序的应用

  1. 基因组组装：长读长组装起来更快更准确。
  2. 识别结构变异：短读长无法识别的结构变异用长读长的reads可以识别了。

4.3. PacBio SMRT测序

Pacific Biosciences（PacBio）公司三代测序平台Sequel & Sequel II基于零模波导特性（zero-mode wave-guides, ZMWs）的单分子实时测序技术（SMRT）进行测序。

4.3.1. PacBio三代建库

  1. PacBio三代建库是在已打断为一定长度（10-20kb或更长）的双链DNA分子两端连接带有发卡（hairpin）结构的PacBio接头（adaptor），使DNA分子形成“哑铃形”SMRTbell文库。

4.3.2. SMRT测序原理

  1. SMRT 测序是以SMRT Cell为载体，SMRT Cell是纳米制造的，不可回收的消耗品，也叫芯片。每个SMRT Cell上布满了数百万个零模波导孔（ZMW），也被称为well。零模波导孔（ZMW）是单分子实时测序的最小场所。Sequel 系统一个SMRT Cell上面 1M（一百万）个ZMWs， Sequel II系统一个Cell上支持8M个ZMWs。
  2. 测序时DNA聚合酶和一条模板分子被瞄定在ZMW孔底部进行反应，位于小孔底部的激发光能够激发核苷酸底物上的荧光标记，进而通过监测系统的相机（CCD）将荧光信号记录下来，从而获得碱基信息。这一过程在环化的文库上不断重复进行，从而完成测序。
  3. 整个测序过程 DNA 分子不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。

4.3.3. SMRT测序模式

PacBio sequel II平台支持CLR（Continuous Long Reads）和CCS（Circular Consensus Sequencing）两种测序模式。

  1. CLR模式适用超长片段文库（> 25 kb），存储有效数据的文件一般命名为* .subreads.bam。对subreads不再进行后续处理。
  2. CCS模式则适用于普通长度片段文库(< 25 kb)，存储数据的* .subreads.bam文件（subreads）需要后续处理。由于测序过程中每条polymerase read中包含同一分子的多条pass信息，通过一致性校正后（intra-molecular consensus），得到一条唯一的read，称为CCS read，这个校正过程会显著提升测序准确率（从86%提升到99.9%）。质量值大于Q20的CCS read称为HiFi reads(High fidelity reads)，存放于.hifi_reads.bam文件中，这个文件将用于下游的信息分析。

4.4. Nanopore 纳米孔测序

相较PacBio的三代测序技术，Oxford Nanopore Technology公司的Nanopore测序（又叫纳米孔测序）技术使用的较少。

  1. Nanopore测序原理
  • Nanopore测序技术采用的是一种与SMRT不同的原理，即单链 DNA 或 RNA 分子穿过纳米孔，记录核苷酸通过孔时的周围电场的电流变化。
  1. Nanopore测序平台
  • Nanopore测序的特点是便携性和多功能性。手持式 MinION 设备使研究人员能够在传统实验室之外进行测序实验，从而实现对传染病爆发、环境研究甚至太空任务的实时监控。
  • PromethION 是该技术的高通量版本，可提升测序能力以应对更大的项目，包括全基因组测序和元基因组学。
  1. Nanopore测序特点
  • 缺点：插入片段长度最高可达2.3Mbp，通常比PacBio三代reads（30kb）短。
  • 测序reads的准确率约为92-97%。
  • 优点：便携和快速。
  • 优点：纳米孔测序的实时分析。

5. references

  1. 维基-DNA sequencing：https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing#:~:text=Sequencing%20is%20used%20in%20molecular,and%20identify%20potential%20drug%20targets.
  2. 维基-Sanger测序：https://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing
  3. https://biopic.pku.edu.cn/gtlcxzx/ptjs/swxxfx/index.htm
  4. https://www.cnblogs.com/leezx/p/6136297.html
  5. 第一代到第三代基因组测序技术原理：https://www.cnblogs.com/huangshujia/p/3233693.html
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