三代基因组测序PacBio CLR和CCS模式下机数据的预处理

1. SMRT测序模式

PacBio sequel II平台支持CLR（Continuous Long Reads）和CCS（Circular Consensus Sequencing）两种测序模式。 （sequel平台好像只支持CLR模式）

1. CLR模式适用超长插入片段文库（>20kb），存储有效数据的文件一般命名为* .subreads.bam。对subreads不再进行后续处理。
2. CCS模式则适用于普通长度插入片段文库(1-20kb)，存储数据的* .subreads.bam文件（subreads）需要一致性校正后生成CCS reads或HiFi reads用于下游分析。

2. CLR模式

1. CLR模式下机数据

• *subreads.bam是以bam格式存储CLR测序数据的下机原始数据。
• 因为每条插入片段只测了一次，不需要进行reads的一致性校正，生成consenses reads这一步骤（Pacbio CCS模式生成的subreads则需要合并生成CCS reads才能用于下游分析）。

2. CLR模式数据文件命名规则

• 文件名：P01TYD19110566-1_r64031_20191018_094227_2_B01.subreads.bam的含义
• P01TYD19110566-1：文库号，即library ID。
• r64031_20191018_094227：样本所在run的ID号码，编号唯一，格式为”r机器号_日期_时间”。
• 2_B01：cell编号。

3. CLR模式数据预处理

• CLR的subreads没有单碱基质量数据，所以bam文件转化为fa文件即可（而不必转为fq文件）。
• 可以用bam2fasta直接把*subreads.bam转换成fasta格式文件用于后续分析。bam2fasta sample.subreads.bam -c 9 -o sample.subreads命令会生成sample.subreads.fasta.gz文件，-c 9代表压缩程度为9。

3. CCS模式

1. CCS模式下机数据

• 拿到PacBio CCS模式测序数据时，例如下载公共数据尤其是早期数据时，一定要弄清楚是subreads，还是HiFi reads。
• 对于近期从测序服务商那里得到的数据一般都是运行完CCS软件后的HiFi reads。（文件为下机的ccs.bam或者hifi_reads.bam），可直接用于下游分析。
• 需要注意的是，如果拿到的是subreads.bam数据，则subreads数据需要通过一致性校正后（intra-molecular consensus），得到一条唯一的read，称为CCS read，再用于下游分析。这个校正过程会显著提升测序准确率。

2. CCS模式数据的几种类型reads

• polymerase reads：对环状的SMRTbell文库分子测序得到的reads，可能多次读取环状分子。（保存在zmws.bam文件）
• subreads：从polymerase reads序列中去掉哑铃状的测序接头序列，可以得到多条subreads序列。（保存在subreads.bam文件，被废弃的adapter和低质量序列保存在scraps.bam文件）
• CCS reads：环状一致性序列，从一个polymerase reads上的多条subreads序列，进行一致性校正得到的一条准确率更高的序列。（保存在CCS.bam文件）
• HiFi reads (High fidelity reads)：质量值大于Q20的CCS reads，即为HiFi reads。（保存在hifi_reads.bam文件）

Figure 1. CCS reads处理，图片来源： https://cehs.mit.edu/pacific-biosciences-sequel

3. 一致性校正（subreads to CCS reads）

• 如果拿到的是subreads数据，则需要进行一致性校正，把数据转化为CCS reads。
• PacBio官方smrtlink软件中的CCS工具可将subrads.bam转换为ccs.bam，命令如下:ccs *.subreads.bam *.ccs.bam。
• 分割文件并行转换可以加速，下面代码示例为分成10份运行：：

ccs *.subreads.bam *.ccs.1.bam --chunk 1/10 -j <THREADS>
ccs *.subreads.bam *.ccs.2.bam --chunk 2/10 -j <THREADS>
...
ccs *.subreads.bam *.ccs.10.bam --chunk 10/10 -j <THREADS>
pbmerge -o *.ccs.bam movie.ccs.*.bam

4. CCS模式数据预处理

• 使用CCS read或HiFi reads（通常做一致性校正后reads质量都大于Q20，所以CCS reads就是HiFi reads）可以进行下游分析，有时下游分析需要fa格式。
• CCS reads没有单碱基质量数据，所以bam文件转化为fa文件即可（而不必转为fq文件）。
• 可以用bam2fasta直接把*ccs.bam转换成fasta格式文件用于后续分析。bam2fasta sample.ccs.bam -c 9 -o sample.ccs命令会生成sample.ccs.fasta.gz文件，-c 9代表压缩程度为9。

references

1. 一致性校正：https://freewechat.com/a/MzA3MjM5NTE4Mg==/2247483719/1
2. CCS模式测序：https://cloud.tencent.com/developer/article/2346853

---

• 欢迎关注微信公众号：生信技工
• 公众号主要分享生信分析、生信软件、基因组学、转录组学、植物进化、生物学概念等相关内容，包括生物信息学工具的基本原理、操作步骤和学习心得。